Western Blotting

Separazione di miscela di proteine secondo la dimensione in gel di poliacrilamide, trasferite (blotted) ad una membrana.

Le proteine possono essere visualizzate complessando un anticorpo primario e uno secondario

Tecnica molto diffusa per l'analisi delle proteine: 57% del totale circa

Separazione di Proteine

I campioni contenenti le proteine sono miscelati con il tampone di carico (loading buffer) e caricate sull’ SDS-PAGE gel

Le proteine attraverso l’elettroforesi sono separate a seconda della loro dimensione

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Western Blot Transfer

Le proteine separate sono trasferite dal gel su una membrana (PVDF or nitrocellulose) con l’elettro-blotting

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Western Blot Detection

Dopo il trasferimento, I siti non specifici vengono bloccati con un tampone che contiene proteine (BSA, milk, Detector Block).

L’incubazione degli anticorpi primario e secondario/coniugato seguono il blocco

Dopo il lavaggio della membrana, il coniugato viene riconosciuto aggiungendo il substrato cromogenico e chemiluminescente

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Protocollo Base Western Blotting

Separazione proteine su gel acrylamide
Trasferimento sulla membrana
Blocco della memebrana
Incubazione con Ab I°
Lavaggio I
Incubazione con il Ab II° coniugato
Lavaggio II
Visualizzazione con substrato

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Western Blot Risultati...

Le bande indicano la dimensione e la presenza di specifiche proteine (linea per linea), La dimensione è determinata dalla comparazione di standard di peso molecolare.

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Prodotti per Western Blotting

Anticorpi secondari e coniugati	Unlabeled, Biotinylated, HRP or AP Conjugates, Fluorescent Conjugates
Washing Solution	50-63-00
Blocking Solutions	Milk, 50-82-01
	BSA, 50-61-00 e 50-61-01
	Detector Block 71-83-00
Substrates
	BCIP/NBT and CDP-Star (AP Substrates)
	4CN
	TMB o la sezione dedicata con tutte le caratteristiche
	LumiGLO
	LumiGLO Reserve (HRP Substrates)
Substrate Kit 600 cm2 (54-71-01)	10 ml Solution A (Luminol), 20 ml Solution B (Reaction Buffer), 100 mm Wash Solution Concentrate
Substrate Kit 2400 cm2 (54-71-00)	40 ml Solution A, 80 ml Solution B, 2 x 200 ml Wash Solution Concentrate
Protein Detector LumiGLO Reserve Western Blot Kit (54-13-50)	40 ml Solution A, 80 ml Solution B, 2X120 ml 5X Detector Block Solution, 10g Detector Block Power, 2x200 ml Wash Solution Concentrate, .075 ml HRP anti-mouse and anti-rabbit conjugates

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Protein Detector Kit
Rivelazione chemiluminescente e cromogenica delle proteine in immunoblots.

• LumiGLO ReserveTM Peroxidase Chemiluminescent System sensitivity to the femtogram range*
• LumiGLO® Peroxidase Chemiluminescent System - sensitivity to the low picogram range*
• TMB Peroxidase Chromogenic System - sensitivity to the high picogram range*
• BCIP/NBT Phosphatase Chromogenic System - sensitivity to the low nanogram to high picogram range*
  
  *Sensitivity is greatly dependent on the affinity of the primary antibody to the antigen of interest

 

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Protein Detector Kit Contenuto delle confezioni

5X Detector Block with Powder (Powder is not supplied with the AP kit)
20X Wash Solution Concentrate
Substrate (BCIP, TMB or LumiGLO, or LumiGLO Reserve)
AP or HRP labeled secondary Ab
both anti-rabbit and anti-mouse in each kit

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Improved Detector Block

Formulazione esclusiva soluzione 5X Detector Block e polvere forniscono un blocco incredibilmente selettivo per i segnali non specifici senza perdità di sensisività.

Solubilizza velocemente senza necessità di energia (forno a microonde)

Detector Block

Detector Block contro BSA

Nettamente vincente il detector Block, in un sistema che deve rivelare una matrice (Human) di metallo proteinase 2 (aka gelatinase A 72 Kd type IV collagenase A. MMpP è stata rivelata usando 20 ng/ml di un anticorpo primario Rabbit anti MMP-2 e Lumiglo Western Blotting KIT come protein detector con HRP anti rabbit. Esposizione 10 minuti

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KPL Chromogenic Western Blot Kits

Protein Detector TMB Western Blotting Kit

Protein Detector BCIP/NBT Western Blotting Kit

• Non è necessario alcun equipaggiamento speciale.
• Substrato molto stabile
• Segnale eccellente rispetto al disturbo
• Ideale per chi non ha necessità di un alto livello di sensività.

 

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LumiGLO Chemiluminescent Substrate
Substrato: Luminolo catalizzato con perossidasi. Fornisce grande linearita del segnale relativo alla concentrazione della proteina

	Beta-gal elettroforizzato e trasferito a PVDF Detected con anti- beta-gal e goat anti-rabbit IgG - HRP Trattato con LumiGLO e ECL; esposizione 10 minuti

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Western Blotting LumiGLO

	Rabbit IgG detected con Protein Detector e anti-rabbit HRP (1:10.000) 30 secondi
	Rabbit IgG detected by Protein Detector and anti-rabbit HRP (1:10,000) 1 minuto
	(1:10.000) Beta-Gal detected con Protein Detector Mouse anti-Beta-Gal monoclonale e anti Mouse HRP 10 minuti

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LumiGLO ReserveTM

Substrato chemiluminescente a due componenti

54-71-01 Substrate Kit, 600 cm2
10 ml Solution A (Luminol), 20 ml Solution B (Reaction Buffer), 100 ml Wash Solution Concentrate

54-71-00 Substrate Kit, 2400 cm2
40 ml Solution A, 80 ml Solution B, 2 x 200 ml Wash Solution Concentrate

54-13-50 Protein Detector LumiGLO Reserve Western Blot Kit
40 ml Solution A, 80 ml Solution B, 2 X 120 ml 5X Detector Block Solution, 10g Detector Block Power, 2 x 200 ml Wash Solution Concentrate, .075 ml HRP anti-mouse and anti-rabbit conjugates