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Western Blot. FASE 1 Corsa elettroforetica

Indice Indice westernBlot
Fase 1 Corsa elettroforetica
Fase 2 Incubazione con anticorpo primario e secondario
Fase 3 Rivelazione

La prima fase comporta la preparazione di un estratto proteico dalle cellule da cui viene separata la proteina di interesse mediante elettroforesi verticale in Gel di SDS-poliacrilammide o con il nuovissimo NextGel di Amresco

ChemiBlot™ Molecular Weight Marker Kit
Vi segnaliamo: ChemiBlot™ Molecular Weight Marker Kit
Pesi molecolari, si colorano con il secondario durante la rivelazione.
Non è quindi necessaria un'ulteriore rivelazione

Il ChemiBlot è una miscela di proteine artificiale che si legano alle IgG con la struttura dei domini A-B della Staphylococcal protein A ripetuti linearmente da 1 a 6 volte [pA(AB1 to pA(AB)6] 1. Le sei proteine artificiali sono sintetizzate separatamente con E. coli geneticamente modificato e purificate con cromatografia di affinità su colonne di IgG. Questo prodotto mostra sei bande differenti sull'SDS-PAGE. I markers possono essere utilizzati per la stima dei pesi molecolari sul gel e come controllo positivo per il Western blot 3.

ChemiBlot™ Molecular Weight Marker Kit
Applicazioni: Stima del peso molecolare su SDS-PAGE; 10 µL / lane per colorazione con CBBR (Coomassie Brilliant Blue R-250), 2 µL / lane per silver staining. Controllo positivo 3 per Western blottting / immunostaining; 2 µL / lane Pesi Molecolari: 14,800, 28,201, 41,603, 55,004, 68,406 and 81,807. I pesi molecolari sono calcolati sulla composizione amminoacidica. Presentazione: 5 µg cadauno di pA(A-B)1-6 contenuto in 200 µL di tampone 2 per SDS-PAGE [62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8) – 2% SDS – 5% glycerol – 0.005% Bromophenol Blue]. 2 µL del risultante contiene 0.05 µg cadauno di pA(AB)1-6.

Descrizione Quantità Codice
ChemiBlot™ Molecular Weight Marker kit40 µL x 5 vials 2230
ChemiBlot™ Molecular Weight Marker kit-Trial 40 µL 2230-S

Elettroforesi Verticale

Descrizione Quantità Codice
Acryl/Bis 19:1, sol. 40%500 ml 0496
Acryl/Bis 29:1, sol. 40%500 ml 0311
Acryl/Bis 37.5:1, sol. 40%500 ml 0254
Acryl-40500 ml 0132
Bis-Acryl100 gr 0172
APS100 gr 0486
TEMED50 ml 0761 
Dimethyl Sulfoxide (Dmso) DMSO500 ml 0231
Next Gels link specifico

Trasferimento su membrana
Dopo la corsa su gel le proteine vengono trasferite dal Gel ad una membrana di nitrocellulosa.

Apparecchio per il trasferimento e membrane disponibili sul catalogo ROTH
Trasferimento su membranaIncubazione con anticorpo primario e secondario
La membrana, su cui sono state trasferite le proteine, viene incubata con una soluzione contenente l'anticorpo specifico per la proteina di interesse. Segue un'incubazione con un anticorpo secondario legato ad un enzima che servirà per la rivelazione.

 
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